【卡梅德生物】基因编辑技术之CRISPR-Cas9系统解说

刺骨的言语ヽ痛彻心扉 2024-05-24 12:38 9阅读 0赞

**CRISPR-Cas9基因敲除系统（knock out）原理****：**

[CRISPR-Cas9基因][CRISPR-Cas9]敲除系统是Cas9内切酶切割双链DNA，生物体启动NHEJ修复途径，切割位点产生移码突变，导致基因沉默。首先在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。而生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，DNA断裂处插入或缺失几个碱基，然后双链DNA的切割末端连接在一起，从而实现了细胞中目标基因的敲除。这个过程极容易导致切割位点发生移码突变，从而沉默该基因

**CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）原理：**

CRISPR-Cas9基因敲入系统：Cas9内切酶切割双链DNA，同时DNA修复模板质粒（供体DNA分子）存在的情况下，生物体内启动HDR修复路径，按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变。这样就可以实现基因的替换或者突变。 HDR机制可以通过同源重组将一段DNA序列插入切割位点。这种修复方式可以将一段外源的DNA序列精准地插入特定的基因组位点。

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图1基因敲入原理图

**CRISPR-Cas9****基因敲除系统（****knock out****）流程：**

1.  设计sgRNA

涉及sgRNA后，进行软件分析预测，sgRNA没有脱靶结合位点。

（2）构建sgRNA-Cas9载体

（3）构建sgRNA-Cas9稳转株

利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株，进行嘌呤筛选

（4）筛细胞克隆并进行qPCR验证

嘌呤霉素筛选后分离阳性克隆。提取基因组DNA并进行验证测定目的基因座是否进行编辑

（5）阳性克隆测序，选择敲除纯合细胞株

通过Sanger测序进一步分析阳性克隆的PCR产物以确定敲除的性质

（6） 筛选细胞单克隆测序

通过有限稀释法选择阳性单克隆。提取基因组DNA，进行PCR扩增，克隆和测序。

（7）进一步测序，确定纯合突变

**CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in）流程：**

实验流程

（1）设计sgRNA-Cas9及修复DNA模版

设计了sgRNA进行软件分析，预测设计的sgRNA没有脱靶结合位点。同时合成DNA修复模版，两侧同源臂，两侧各有600bp的同源臂。

（2）构建sgRNA-Cas9质粒及修复DNA模板质粒

将选定的sgRNA设计与CMV启动子驱动的Cas9基因一起克隆到载体上。将DNA修复模板插入含有RFP-嘌呤霉素的表达载体。

（3） 将sgRNA-Cas9、修复DNA模版共转工具细胞

选择合适的转染试剂将上述两种质粒转染工具细胞。

（4）嘌呤筛选，检测荧光

（5）PCR检测基因组，RFP蛋白是否敲入

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[CRISPR-Cas9]: https://www.kmdbioscience.cn/pages/crisprqiaochuxibaoxi.html
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[Link 1]: https://www.kmdbioscience.cn/