png数据和深度数据_RNAseq数据深度分析—motif的鉴定

叁歲伎倆 2023-01-12 10:14 78阅读 0赞

在最初的基因表达，我们通常做RT-PCR，半定量RT-PCR，northern bloting等等，后来我们又通过microarray来考察基因表达水平。随着测序技术的飞速发展，RNA-seq在现在的我们实验设计中，为了验证基因表达水平，以及关联基因的表达变化，越来越成为一个重要的part。

通常来讲，RNA-seq的差异基因表达分析按照前面已经写过的流程进行。RNA-seq数据分析-reads mapping，RNA-seq数据分析-edgeR。但是，我们往往把RNA-seq的数据分析仅停留在差异表达基因的鉴定，然后再做GO分析和KEGG pathway的分析，而事实上，更为重要的是进行深度的挖掘分析。这里，我们可以看一个例子：

组蛋白的翻译后修饰可调节影响多种生物学功能的基因表达。拟南芥组蛋白甲基转移酶SET DOMAIN GROUP 8和25(SDG8，SDG25)调节pep1和flg22触发的免疫和系统获得性抗性。SDG8和SDG25通过调控基因表达调控后续生物学功能。通过生物学试验已经证明SDG8和SDG25的功能。

为了进一步验证基因表达水平，我们试验样品进行了RNA-seq分析，通过基因表达差异分析，我们鉴定了在突变体sdg8和sdg25中的上调和下调的差异基因。

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进一通过GO term分析，我们鉴定了这些差异基因的生物学function。

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为了进一步对GO term可视化分析，我们对这些关键GO term构建了网络分析。

表达上调基因GO term网络：

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表达下调基因的GO term网络

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通过网络构建，我们可以清晰的看到和基因组相关的基因表达被SDG8和SDG25调控，具体信息可以看原文。

这个时候我们就产生一个疑问，是不是这些基因具有某种在序列上具有某种特殊的作用位点呢？我们选取了这些差异基因的上游1000bp序列进行了motif分析。分析结果表面这些基因具有如下共同的motif：

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通过这些motif分析，我们进一步理解了sdg8和sdg25的调控方式，如果后面能够进一步的进行生物试验验证，就会进一步验证这些预测结果。

怎么进行motif分析呢？其实很简单

第一步：提取差异基因的上游序列，一般来讲，植物基因的promotor区在基因上游500-3000bp，所以我们可以提取每个差异基因的上游3000bp以内的序列进行motif预测。

第二步：对提取的序列做motif预测

预测常用的软件MEME，软件链接如下：

http://meme-suite.org/。

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既可以通过online预测，也可以在server上安装meme。

meme的安装很简单，可以参考manual的介绍.最简单的安装方式是进行conda安装。

conda install -c bioconda meme

meme的本地运行可以用如下command

meme [options] <primary sequence file>

简单运行例子如下，具体更多例子，大家可以参照manual说明。

meme crp0.s -dna -mod oops -pal

结果会产生如下四个文件：

meme.html - an HTML file that provides the results in an interactive, human-readable formatmeme.txt - a plain text file of the results for backwards compatibility with earlier versions of MEMEmeme.xml - an XML file that provides the results in a format designed for machine processinglogoN.png,.eps - PNG and EPS images files containing sequence logos for each of the motifs found by MEME (where N is the motif number)logo_rcN.png,.eps - (complementable alphabets only) PNG and EPS images files containing reverse-complement sequence logos for each of the motifs found by MEME (where N is the motif number)

**参考文献：**

Global Regulation of Plant Immunity by Histone Lysine Methyl Transferases. Sanghun Lee, Fuyou Fu, Siming Xu, Sang Yeol Lee, Dae-Jin Yun, Tesfaye Mengiste. The Plant Cell Jul 2016, 28 (7) 1640-1661; DOI: 10.1105/tpc.16.00012

Timothy L. Bailey and Charles Elkan, "Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers", Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28-36, AAAI Press, Menlo Park, California, 1994.

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